从理论到应用——土壤病毒研究的潜在应用前景从理论到应用——土壤病毒研究的潜在应用前景

 

病毒是地球上数量最多的生物实体，在调控宿主群落组成、推动宿主进化及影响土壤元素的生物地球化学循环等方面起着非常重要的作用。

 

本文分析了土壤病毒生态学常用研究方法，阐述了土壤病毒的多样性、病毒在土壤生态系统中的生态功能；展望了环境噬菌体的应用及发展前景。

 

病毒是地球上数量最多的生物实体，可以感染任何细胞生物。据估计，地球上存在4.80×10³¹个病毒颗粒，约为原核细胞数量的10倍。

 

 

地球上不同环境中病毒颗粒丰度估算

 

土壤中约含有4.88×10³⁰个病毒颗粒，它们可调控微生物的死亡率和群落结构、推动宿主进化以及影响土壤元素的生物地球化学化学循环，在构建健康土壤环境、调控根际微生态、促进植物生长，乃至影响全球气候变化等方面发挥重要作用。

 

土壤病毒的研究方法

 

病毒的表型与丰度

 

土壤病毒表型及丰度的测定方法主要有噬菌斑计数、荧光显微镜（EFM）计数、透射电镜表型及计数以及流式细胞仪计数等。

 

EFM对研究土壤中病毒丰度、病毒与微生物的丰度比（VMR）及病毒的复制策略至关重要，但由于无法检测单链DNA和RNA病毒，EFM可能会低估病毒丰度。

 

 

土壤病毒荧光显微计数

 

Williamson等发现不同土壤类型中的游离病毒丰度差异较大，一般来说在热沙漠中最低，在农田土壤和冷沙漠中居中，在森林和湿地土壤中最高。

 

结合meta分析发现土壤病毒的丰度受多种环境因子的影响，如pH值、温度、土壤湿度、土壤深度等。

 

病毒的分子标记基因多样性

 

病毒缺乏通用型引物，仅在某些病毒类群中存在一些相对保守的基因，通过这些标记基因可以研究特定病毒类群的系统发育关系和多样性。

 

 

上表归纳了一些常见的病毒标记基因，其中g20和g23是常用的标记基因，phoH基因也常被用于海洋噬菌体多样性的研究，且不局限于某一特定的噬菌体家族。

 

但由于病毒的功能基因保守性较低，容易出现扩增序列的假阳性，因此将标记基因用于病毒丰度的测定及大量样品的研究还存在一定的局限性。

 

宏病毒组学研究

 

目前，宏病毒组学是病毒多样性研究的主要手段，一般需要采取3个主要步骤：对环境样品中的病毒进行浓缩、纯化浓缩后的病毒粒子以减少污染、测序前扩增病毒核酸。

 

 

土壤病毒组DNA提取过程

 

土壤宏病毒组学目前还处于初级发展阶段，受到各方面的挑战，例如将病毒与土壤颗粒有效分散、分离病毒粒子、有效扩增病毒DNA、有限的土壤病毒数据库等。

 

土壤性质的高度可变性可能会影响土壤病毒吸附与重悬浮，不同土壤类型需要采用不同的重悬浮方法。

 

病毒粒子提取方法主要有切向流过滤、聚乙二醇沉淀法和氯化铯密度梯度离心法。

 

宏病毒组生物信息学分析

 

宏病毒组分析是土壤病毒生态学研究的重点，主要包括3个关键步骤：去除污染的细胞DNA、病毒的物种和功能注释、病毒宿主溯源。

 

在病毒提取及测序过程中可能会引入一些污染的细胞DNA，在分析病毒基因组前需要去除潜在的细胞基因组。

 

目前国外学者相继开发出多款数据分析软件用于宏病毒组数据的解析。

 

预测病毒宿主也是了解病毒生态功能的重要手段之一，目前的方法主要有：基于病毒基因组与参考病毒基因组之间的相似性，通过参考基因组获取病毒宿主信息；基于病毒基因组与宿主基因组之间的相似性；根据宿主核苷酸特征来推测，但这种方法仅能预测属以上水平的宿主；通过比较宿主和病毒序列在空间及时间尺度上的丰度分布来计算预测相关性，或通过更复杂模型的交互作用来预测宿主。

 

目前仍存在一些技术问题亟待解决：病毒的富集依然是病毒组研究的瓶颈，该过程中浸提液的选择也至关重要；因病毒的基因组较小，实际直接提取的病毒DNA量很难达到测序要求；公共数据库中病毒数据库的占比仍非常小，且对病毒组分析发现土壤中近70%的病毒基因序列是未知的。

 

总的来说，鉴于目前有限的土壤类型以及样品数量，土壤病毒学的发展仍然任重而道远。

 

土壤病毒的生态功能

 

病毒调控宿主群落组成

 

根据病毒在宿主中的复制策略，可将病毒分为烈性病毒、溶源性病毒及慢性病毒。

 

烈性病毒的繁殖周期主要包括吸附、侵入、复制和生物合成、组装、裂解这5个阶段；溶源性病毒在侵染宿主时，可将自身的遗传物质整合到宿主的基因组中，或以质粒的形式存在于细胞内，并伴随着宿主的繁殖进行复制，但不产生子代病毒；慢性病毒可侵染宿主，在宿主胞内复制繁殖，但遗传物质不整合到宿主基因组上，该过程可导致宿主的生长和代谢变得缓慢。

 

烈性病毒（这里主要指烈性噬菌体）对宿主种群控制的动态变化遵循捕食-被捕食关系的经典规律。

 

如杀死优胜者（KtW）假说，该模型认为密度和频率依赖的病毒捕食可抑制快速生长的优势菌群的繁殖，维持受攻击宿主的种群平衡从而保持微生物群落的多样性，在海洋和土壤生态系统中均观察到了KtW现象。

 

此外，Knowles等提出了PtW模型，认为在海洋中宿主密度的升高将增加溶源性过程，即“微生物越多，病毒越少”，近期发现PtW现象也存在于土壤中，但影响病毒的分布特征及复制策略的驱动因子目前仍不清楚。

 

病毒影响宿主进化

 

病毒在感染宿主时，向宿主细胞内引入新的基因，从而引起基因重组，这一过程称为病毒介导的水平基因转移——转导。

 

普遍转导发生于烈性感染时，在裂解周期中，新病毒颗粒的衣壳可能会意外包裹宿主DNA，在病毒感染下一个宿主时，将误装入的遗传物质释放到新的宿主内，在宿主基因组中发生重组。

 

溶源性病毒介导的转导为局限性转导，病毒特异性切断宿主基因组，将某一段基因整合到自己的基因组上，感染下一个宿主时发生基因重组。

 

所有的转导过程都对宿主基因组有重要影响，尤其是局限性转导赋予宿主新的功能，增强宿主的适应性，扩宽宿主的生态位，同时也促进了宿主的进化。

 

细菌-噬菌体共同进化增强了细菌和噬菌体的表型和遗传多样性，是微生物群落进化过程的主要推动力，也是微生物生态学研究的核心内容之一。

 

细菌在与病毒对抗的过程中，形成了多种防御机制，如细菌通过改变噬菌体的结合受体，以及通过限制-修饰系统或者CRISPR-Cas系统抵抗病毒感染。

 

当宿主改变表面或内部噬菌体吸附相关的结构时，噬菌体也可以修改其目标受体或者与宿主相互作用的结构，使其能够再次与宿主进行有效的相互作用。

 

于是一场关于进化的“军备竞赛”应运而生，（迭代的）选择性过程驱动生物相互作用的多样性，提高进化速率，从而推动宿主进化。

 

病毒参与土壤元素的生物地球化学循环

 

病毒作为生物泵影响土壤元素生物地球化学循环

 

病毒是海洋碳循环的重要驱动者，由病毒推动的碳循环量占整个海洋生态系统碳循环总量的6%~26%。

 

海洋环境中微生物被病毒裂解后产生细胞碎片，其中可溶性有机物可以被微生物迅速利用，而颗粒态有机物可以沉降至含氧量很低的海底稳定保存，这一过程称为生物碳泵。

 

病毒的裂解式捕食方式使海洋表层每年可向深层海域输送3 Gt的碳。

 

此外，病毒裂解的微生物可被细菌再矿化，起着海洋再循环系统的作用，这一过程被称为病毒转轨。

 

土壤中同样也存在病毒转轨过程，即土壤微生物被病毒感染裂解死亡，导致微生物中的营养元素释放出来被其他微生物和植物利用。

 

病毒携带辅助代谢基因间接参与土壤元素生物地球化学循环

 

随着宏基因组学或宏病毒组学的发展，在海洋中发现了大量病毒携带宿主的辅助代谢基因（AMGs），涵盖多种参与元素循环的关键步骤基因。

 

这些AMGs可以在病毒侵染宿主后在宿主胞内表达，改变宿主代谢过程，从而参与元素的生物地球化学循环，同时赋予宿主新的功能，拓宽其生态位。

 

迄今研究最为深入的关于病毒AMGs功能的例子在海洋蓝藻细菌的光合作用中，蓝藻病毒光合基因psbA和psbD来源于宿主，当宿主蛋白合成因光抑制被暂停时，其编码的D1和D2蛋白可在光损伤修复循环中发挥关键作用。

 

Roux等揭示了病毒可能直接参与整个海洋系统的硫和氮循环。

 

随后的一些研究也证实了土壤病毒携带多种AMGs，可能影响土壤的碳过程、帮助宿主抵御重金属的胁迫。

 

需要注意的是，病毒携带的AMGs主要编码不同的能量代谢路径，宿主的翻译和翻译后水平调控机制等的修饰。

 

病毒（噬菌体）的应用

 

噬菌体疗法已经在医学领域使用了近1个世纪，但从未成为主流医学方向。而由于超级细菌的出现，“噬菌体疗法”的概念重新受到关注。

 

目前噬菌体疗法在医学中的案例还非常有限。2016年，噬菌体挽救了一位感染了超级细菌鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）的患者；2018年，一个感染了对抗生素有耐药性的人类分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）的女孩，在经过3种噬菌体的“鸡尾酒”的治疗后病情得到有效控制。

 

噬菌体疗法在农业病害防治、畜禽养殖和食品加工中的应用则已经非常广泛，如美国FDA批准了多种相关生物产品，分别用于治疗不同农作物的细菌性斑点病、控制具有特殊食源性危害的单核细胞增多性李斯特菌、净化活体动物从而远离大肠杆菌和沙门氏菌以及防治几种水果的火疫病和溃疡病等。

 

国内学者在噬菌体应用方面也开展了大量研究，如利用金黄色葡萄球菌噬菌体在牛奶中的抑菌应用、假单胞菌噬菌体的筛选及在冷却羊肉中的应用、噬菌体在多种水产养殖疾病中的应用等。

 

菲吉乐科等公司在动植物健康和食品安全等领域也开发了多款噬菌体产品，旨在通过噬菌体技术减少有害病原体的数量。

 

目前噬菌体在土壤及土传病害方面应用的案例正逐渐崭露头角，如噬菌体组合应用于土传病害青枯菌，防控番茄、烟草等的青枯病。

 

噬菌体“鸡尾酒”疗法是一种较好的土传病害解决方法，它包含了不同的噬菌体组合，即使细菌对其中一个噬菌体产生抗性，仍会被其他噬菌体杀死，因此需要积极发展土壤噬菌体资源库的建立，推进噬菌体疗法生物技术的发展。

 

结论

 

由于研究方法的限制，我们对土壤病毒的认识仍是冰山一角，未来的研究任重道远。

 

如针对大量样品的病毒研究方法的开发，以更全面地了解土壤病毒在大尺度上的分布特征；土壤病毒及病毒功能基因资源库的建设，以便更好地服务于噬菌体产品的开发。

 

目前尚未发现噬菌体对人类、动物、植物有不良影响，这使得利用噬菌体特异地抑制土壤细菌污染、致病菌或耐药菌成为可能，是一种“绿色”的生物技术。

 

因此，在细菌耐药性及后抗生素时代发展的趋势下，噬菌体疗法也有望成为抗生素的有效替代品。

 

本文作者：韩丽丽，曹苗苗，毕丽，张丽梅，贺纪正

作者简介：韩丽丽，中国科学院生态环境研究中心、城市与区域生态国家重点实验室、中国科学院大学，副研究员，研究方向为土壤病毒生态学。

 

论文全文发表于《科技导报》2022年第3期，原标题为《土壤病毒的研究进展与应用前景》，本文有删减